AFB-Färbungen: Kinyoun vs Fluoreszenz vs Ziehl-Neelsen

AFB-Färbungen: Kinyoun vs Fluoreszenz vs Ziehl-Neelsen

AFB-Färbungen sind Spezialfärbemethoden, um säurefeste Bakterien – „acid fast bacilli“ (AFB) zu färben. Dazu gehören die Färbung nach Kinyoun, die AFB-Fluoreszenz-Färbung und die Färbung nach Ziehl-Neelsen ^[1].

Diese AFB-Färbemethoden zielen darauf ab, säurefeste Bakterien, insbesondere Mykobakterien, nachzuweisen, in dem sie eine farbliche Unterscheidung zwischen säurefesten und nicht-säurefesten Bakterien ermöglichen. Die säurefeste Zellwand dieser grampositiven Bakterien besteht aus Mykolsäuren. Nach Anfärben lassen sich die säurefesten Bakterien aufgrund dieser spezifischen Zellwandstruktur durch Säuren nicht wieder entfärben ^[2].

AFB-Färbungen: Nachweis von Tuberkulose, Lepra und Co.

AFB-Färbungen werden vor allem zum Nachweis von Mycobacterium tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose (TB), Mycobacterium leprae, dem Erreger der Lepra, sowie atypische Mykobakterien eingesetzt ^[3].

Tuberkulose (TB) ist eine Infektionskrankheit, die durch Bakterien des Mycobacterium-tuberculosis-Komplexes verursacht wird. Zu dieser Gruppe gehören Mycobacterium tuberculosis, der Hauptverursacher von Tuberkulose beim Menschen, sowie M. bovis und weniger pathogene Stämme wie M. microti, M. africanum und M. canetti ^[3]. Laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) ist etwa ein Viertel der Weltbevölkerung mit M. tuberculosis infiziert. Davon entwickeln etwa fünf Prozent tatsächlich eine Tuberkulose Erkrankung. Jährlich sterben etwa 1,4 Millionen Menschen an TB ^[4].

Die AFB-Mikroskopie spielt eine entscheidende Rolle bei der Diagnose von Lungentuberkulose, insbesondere in Ländern mit niedrigem Einkommen, da sie schneller und kostengünstiger ist als PCR-Tests. Angesichts der anhaltenden Verbreitung der Erkrankung bleibt die AFB-Färbung ein verlässliches Diagnosewerkzeug ^[2].

Neben M. tuberculosis können durch AFB-Färbemethoden auch atypische säurefeste, nichttuberkulöse Mykobakterien (NTM) nachgewiesen werden. Diese sind in der Umwelt weit verbreitet (z.B in Erde und Wasser) und verursachen sogenannte „atypische Mykobakteriosen“, die die Lunge, die Haut und die Lymphknoten befallen können ^[5]. Zu dieser Gruppe gehören Mycobacterium avium, M. kansasii und M. xenopi ^[4].

AFB-Färbungen: Die Ziehl-Neelsen-Färbung

Die Methode wurde nach dem deutschen Bakteriologen Franz H. Ziehl (1857-1926) und dem Pathologen Friedrich Carl Adolf Neelsen (1854-1894) benannt. Ziehl war Professor in Lübeck und entwickelte 1882 eine Karbolfuchsin-Färbung zum Nachweis säurefester Bakterien. Dabei stützte er sich auf die Arbeiten des Bakteriologen und Serologen Paul Ehrlich ^[6].

Neelsen war Professor am Pathologischen Instituts der Universität Rostock und wurde später leitender Chefarzt des Pathologischen Instituts der Universität Dresden. Neelsen starb im Alter von 40 Jahren aufgrund seiner Forschungen mit gefährlichen Bakterien.

Gemeinsam entwickelten die beiden Professoren die nach ihnen benannte Ziehl-Neelsen-Färbung. Neelsen kombinierte Ziehls Färbung mit der spezifischen Technik der Erwärmung und fügte den Entfärbungs- sowie den Gegenfärbungsschritt hinzu ^[7].

Bei der Ziehl-Neelsen-Färbung wird zunächst ein Abstrich des zu untersuchenden Materials (z.B. Sputum, Bronchialsekret, Ergussflüssigkeiten oder Urin) auf einem Objektträger fixiert ^[3]. Anschließend wird die Probe mit Karbolfuchsin (einem intensiv roten Farbstoff) bedeckt und bis kurz vor dem Siedepunkt erhitzt. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt, da das Erhitzen das Eindringen des Farbstoffs in die lipidhaltige Zellwand erleichtert.

Nach einer Abkühlungsphase wird die Probe mit Leitungswasser abgespült. Daraufhin wird sie mit einer Ethanol-Lösung, die 3%-ige Salzsäure enthält, entfärbt. Der Farbstoff wird dabei aus allen nicht säurefesten Strukturen entfernt. Die säurefesten Bakterien behalten jedoch ihre rote Färbung, da ihre Zellwände den Farbstoff stark binden. Schließlich wird eine Gegenfärbung mit Methylenblau durchgeführt, um die entfärbten Strukturen sichtbar zu machen. Die Auswertung erfolgt mit einem Lichtmikroskop. Dabei erscheinen säurefeste Bakterien rot und alle anderen Strukturen blau. Zusätzlich zur Färbung kann unter dem Mikroskop auch die Morphologie der Bakterien beurteilt werden ^[8].

Die Ziehl-Neelsen-Färbung hat eine Sensitivität von 70% und eine Spezifität von 97,1% für die Lungen-Tuberkulose ^[9]. Sie kann auch zur Bestätigung positiver Ergebnisse bei der Auramin-Färbung (AFB-Fluoreszenz) verwendet werden. Ein Vorteil dieser Kombination ist, dass die Ergebnisse innerhalb weniger Stunden vorliegen ^[3].

AFB-Färbungen: Die Kinyoun-Färbung

Joseph J. Kinyoun (1860-1919), ein US amerikanischer Mediziner, entwickelte die Kinyoun-Färbung. Er war Gründer und erster Direktor des US Hygienelabors auf Staten Island, das später zum National Institute of Health (NIH) wurde. Kinyoun trug maßgeblich zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten wie Cholera in der USA bei ^[10].

Die Kinyoun-Färbung verläuft ähnlich wie die Ziehl-Neelsen-Färbung, jedoch ohne Erhitzen. Aus diesem Grund wird sie als „Kaltmethode” bezeichnet. Die Probe wird ebenfalls mit Karbolfuchsin bedeckt, jedoch bei Raumtemperatur gefärbt ^[2]. Entfärbung und Gegenfärbung entsprechen der Ziehl-Neelsen-Methode.

AFB-Färbungen: Die Fluoreszenz-Färbung

Die AFB-Fluoreszenz-Färbung („acid fast bacilli“-Fluoreszenz-Färbung) ist eine weitere Methode zum Nachweis säurefester Bakterien. Hierbei wird ein fluoreszierender Farbstoff wie Auramin-O oder eine Kombination aus Auramin und Rhodamin verwendet. Die Probe wird zuerst mit dem Fluoreszenzfarbstoff bedeckt und nach dem Einwirken mit Wasser abgespült ^[2].

Ein Erhitzen der Probe ist bei der Fluoreszenz-Färbung nicht erforderlich. Dafür ist die Einwirkzeit länger. Die Probe muss mindestens 20 Minuten mit dem Farbstoff in Kontakt bleiben, um ins Bakterium einzudringen. Wie auch schon bei den zuvor genannten Färbemethoden erfolgt auch bei der Fluoreszenz-Färbung eine Entfärbung. In einem zweiten Schritt wird eine Gegenfärbung mit einer Kalium-Permanganat-Lösung durchgeführt, die die Hintergrundfluoreszenz reduziert ^[2].

Säurefeste Bakterien erscheinen somit als gelb-grün-fluoreszierende Strukturen, während alle anderen Bestandteile bei der Auswertung deutlich zu unterscheiden sind, da sie keine Fluoreszenz aufweisen ^[2]. Die Kombination von Auramin und Rhodamin bietet den Vorteil einer stärkeren Fluoreszenz, somit können säurefeste Bakterien leichter erkannt werden.

AFB-Färbungen: Unterschiede der Färbemethoden

Die AFB-Färbemethoden nach Kinyoun und Ziehl-Neelsen verwenden jeweils Karbolfuchsin als Farbstoff. Dennoch unterscheiden sich die beiden Verfahren voneinander: Bei der Ziehl-Neelsen Färbung wird die Probe erhitzt, während die Kinyoun-Färbung als „Kaltfärbung“ durchgeführt wird.

Die Fluoreszenz-Färbung verwendet anstelle von Karbolfuchsin Fluoreszenzfarbstoffe, entweder Auramin oder eine Kombination aus Auramin und Rhodamin.

Die Auswertung der Ziehl-Neelsen-und der Kinyoun-Färbung erfolgt jeweils mit einem Lichtmikroskop, während bei der Fluoreszenz-Färbung ein Fluoreszenzmikroskop benötigt wird.

AFB-Färbungen: Dauer und Sensitivität der Färbemethoden

In einer Studie wurde die Ziehl-Neelsen-Färbung mit der Fluoreszenzfärbung verglichen.

Dabei wurden beide Färbemethoden als zuverlässig und konsistent bewertet. Auffallend bei der Fluoreszenzmikroskopie ist jedoch, dass sie auch bei niedrigen Bakterienkonzentrationen positive Ergebnisse liefert. Dies deutet auf eine höhere Sensitivität der Färbemethode im Vergleich zu den anderen Färbemethoden hin ^[11].

Generell benötigen die Ziehl-Neelsen-, die Kinyoun- und die Floureszenz-Färbungen nur wenige Stunden von der Probenahme bis zur Ergebnisauswertung. Die Fluoreszenz-Methode ist von allen drei Methoden die schnellste, da sie für die Auswertung von Präparaten nur halb so viel Zeit wie die beiden anderen AFB-Färbemethoden benötigt ^[12].

AFB-Färbungen: Zusammenfassung

Die säurefeste Mikroskopie allein reicht nicht aus, um eine TB-Infektion zweifelsfrei nachzuweisen, da sie nur das Vorhandensein von Mykobakterien zeigt. Da die Mykobakterienkultur Wochen bis zum Ergebnis benötigt, ermöglicht die schnellere MTB-PCR Methode eine rechtzeitige Therapie, während die Mikroskopie weiterhin zur Therapiekontrolle und Heilungsüberwachung eingesetzt wird ^[3].

Im Labor müssen strikte Sicherheitsmaßnahmen beachtet werden, einschließlich eingeschränktem Zugang und Verarbeitung von Proben in einer Sicherheitswerkbank der Klasse 2, um Infektionen zu vermeiden. Die Ergebnisse werden gemäß den Richtlinien des GLI-Handbuchs zur säurefesten Mikroskopie sowie den Standards der WHO und der Internationalen Union gegen Tuberkulose und Lungenerkrankungen bewertet und berichtet ^[13].

AFB-Färbungen: Produkte bei BIOMED

Färbelösungen und Färbeautomaten für die AFB-Färbungen finden sich im Produktportfolio von BIOMED.

Die vielseitigen Färbeautomaten aus der Dagatron–Serie eignen sich unter anderem speziell für die Durchführung aller drei AFB-Färbemethoden: Ziehl-Neelsen, Kinyoun und für die AFB-Fluoreszenz-Färbung.

Für die Ziehl-Neelsen- und Kinyoun-Färbung stehen gebrauchsfertige Färbelösungen zur Verfügung, die optimal auf beide Methoden abgestimmt sind.

Hierzu zählen Ziehl-Neelsen/Kinyoun Methylene Blue in Kombination mit Ziehl-Neelsen/Kinyoun Carbol-Fuchsin und Ziehl-Neelsen/Kinyoun Acid Alcohol.

Für die AFB-Fluoreszenz-Färbung bietet BIOMED die AFB-Färbelösungen Acid Alcohol AFB-Fluoreszenz, Potassium Permanganate AFB-Fluoreszenz sowie Auramine oder Auramin-Rhodamin AFB-Fluoreszenz.

Alle genannten AFB-Färbelösungen können sowohl mit vollautomatischen Färbeautomaten, z.B. aus der Dagatron-Serie, oder für die manuelle Färbung verwendet werden.

Literaturverzeichnis:

1. Doan, C. (n.d.). Spezialfärbungen – Welche, warum und wie? Teil 3: Bakterien, Pilze und andere Mikroorganismen. Leica Biosystems. https://www.leicabiosystems.com/de-de/knowledge-pathway/special-stains-which-one-why-and-how-part-iii-microorganisms-bacteria-and-fungi/
2. Bayot, M. L., Mirza, T. M., & Sharma, S. (2023). Acid fast bacteria. In StatPearls. StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK537121/
3. Gesundheitsportal. (2020). ZN-Färbung. Gesundheitsportal. https://www.gesundheit.gv.at/labor/laborwerte/infektionen-bakterien/labor-ziehl-neelsen-faerbung-ausstrich-zzna1.html
4. World Health Organization. (2024). Global tuberculosis report 2024. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/379339/9789240101531-eng.pdf?sequence=1
5. Fille, M. (2018). Atypische Mykobakteriosen: Was verstehen wir darunter und warum erkranken wir? Universimed. https://www.universimed.com/ch/article/pneumologie/atypische-mykobakteriosen-was-verstehen-wir-darunter-und-warum-erkranken-wir-2117811
6. Wikipedia contributors. (2024). Franz Ziehl. In Wikipedia. https://de.wikipedia.org/wiki/Franz_Ziehl#cite_ref-1
7. Wikipedia contributors. (2023). Friedrich Neelsen. In Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Friedrich_Neelsen
8. Reckort, S., & Blaschke, J. (2024). Ziehl-Neelsen-Färbung. DocCheck Flexikon. https://flexikon.doccheck.com/de/Ziehl-Neelsen-Färbung
9. Abdelaziz, M. M., Bakr, W. M. K., Hussien, S. M., & Amine, A. E. K. (2016). Diagnosis of pulmonary tuberculosis using GeneXpert MTB/RIF assay. European Journal of Public Health, 26(2), 168–172. https://doi.org/10.1093/eurpub/ckv234
10. Wikipedia contributors. (2022). Joseph J. Kinyoun. In Wikipedia. https://de.wikipedia.org/wiki/Joseph_J._Kinyoun
11. Dzodanu, E. G., Afrifa, J., Acheampong, D. O., & Dadzie, I. (2019). Diagnostic yield of fluorescence and Ziehl-Neelsen staining techniques in the diagnosis of pulmonary tuberculosis: A comparative study in a district health facility. Tuberculosis Research and Treatment, 2019, Article 4091937. https://doi.org/10.1155/2019/4091937
12. World Health Organization. (2011). Fluorescent light-emitting diode (LED) microscopy for diagnosis of tuberculosis: Policy statement. World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/44602/9789241501613_eng.pdf
13. Lumb, R., Van Deun, A., Bastian, I., & Fitz-Gerald, M. (2013). Laboratory diagnosis of tuberculosis by sputum microscopy: The handbook. SA Pathology. https://www.stoptb.org/sites/default/files/imported/document/TB_MICROSCOPY_HANDBOOK_FINAL.pdf